Il regolamento della Targa Florio, reso noto alcuni mesi prima della gara, stabiliva le modalità di iscrizione, partecipazione e qualifica delle auto iscritte. Inizialmente, ciascuna casa automobilistica non poteva iscrivere più di quattro vetture, si poteva procedere all'iscrizione di privati solo nel caso in cui tale numero non fosse raggiunto. Col passare degli anni diverse furono le disposizioni in merito: nell'edizione del 1919 per esempio, il numero di vetture iscritte per marca era illimitato. Inoltre veniva stabilita la tassa di iscrizione, il peso e, in seguito, anche la categoria in cui ciascuna auto poteva essere iscritta. I termini di iscrizione scadevano 7 giorni prima della corsa.

Prima della corsa, i commissari di gara smontavano e controllavano personalmente i cilindri del motore per verificare se ci fossero difformità con quanto dichiarato al momento dell'iscrizione. Nel caso di difformità, la vettura non veniva esclusa dalla competizione ma veniva inserita nella cilindrata corrispondente.

Il peso minimo complessivo dei due concorrenti per auto era stabilito a 120 kg.

L'ordine di partenza delle autovetture veniva deciso per sorteggio, prima della divisione in cilindrate delle auto iscritte. Si procedeva all'estrazione dei bussolotti dove c'erano scritte solamente le marche delle auto iscritte: l'ordine del primo pilota a partire veniva deciso dalla casa automobilistica. Dopo la suddivisione delle auto in categorie di cilindrata, le prime a partire furono le auto iscritte alla prima categoria e così via; il sorteggio quindi veniva effettuato sui piloti iscritti.

La distanza che doveva dividere la partenza di ogni vettura venne inizialmente stabilita in base al numero di concorrenti iscritti; in seguito si normalizzò sul minuto di distanza.

Due erano i piloti che potevano alternarsi alla guida, il cambio poteva essere effettuato solo alla fine di ogni giro. I piloti designati alla guida non potevano in nessun caso essere cambiati durante la corsa.

Il rifornimento delle auto inizialmente veniva limitato ai box; in seguito fu ammessa la possibilità di rifornirsi anche lungo il circuito.

I premi assegnati, che variarono dai primi quattro ai primi cinque giunti sul traguardo, comprendevano una somma di denaro e diverse medaglie; il primo classificato riceveva la Targa Florio. Oltre i piloti, tutti i meccanici ricevevano una medaglia

In via transitoria, il comitato organizzatore poteva decidere il trasporto gratuito delle vetture iscritte dai porti di Marsiglia, Genova e Venezia a Palermo. Ogni vettura imbarcata poteva essere accompagnata da due persone anch'esse trasportate gratuitamente.